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腦注射（病毒、細胞注射......）

日期：2022-03-26 21:38:33點(diǎn)擊：0
以小鼠為例，
 
一、技術(shù)原理
 
主要采用腦立體定位技術(shù)，它利用動(dòng)物大腦結構和顱骨表面標志（如前囟、后囟、矢狀縫、外耳道、門(mén)齒位等）來(lái)確定大腦皮層下功能性腦區的X/Y/Z三維坐標位置，以便在非直視暴露的條件下植入微電極、注射針、光纖，進(jìn)一步對其進(jìn)行定向的刺激、損毀、藥物注射、電信號記錄等研究，是腦科學(xué)研究領(lǐng)域常用的重要研究手段。常用的實(shí)驗動(dòng)物，如大鼠、小鼠、豚鼠、貓、鳥(niǎo)類(lèi)等，均有上述結構和（或）定位標志，在進(jìn)行大腦固定后，即可根據腦立體定位圖譜或某些參考文獻所提供的數據確定目標腦區，進(jìn)行定位、注射等操作。
 
二、實(shí)驗材料
 
1、腦立體定位圖譜

 
2、儀器設備、耗材

       
3、實(shí)驗動(dòng)物
C57成年小鼠，4-6周齡，20-30g。
 
三、實(shí)驗步驟
1、動(dòng)物麻醉
采用異氟烷氣體麻醉，將小鼠放入預麻箱，調節高氣流量和麻醉濃度（約4LPM, 5%），小鼠1分鐘內進(jìn)入深麻狀態(tài)（通過(guò)觀(guān)察動(dòng)物活動(dòng)狀態(tài)、呼吸、傾斜預麻箱等方法判斷），取出小鼠，放置于定位儀設備，進(jìn)行頭部固定；

2、頭部固定
選擇帶有定位儀專(zhuān)用氣體麻醉面罩的小鼠適配器，將小鼠的門(mén)齒扣置于適配器（此時(shí)老鼠置于麻醉面罩的腔內，維持麻醉），輕壓鼻梁，前后移動(dòng)適配器，使左右兩側耳桿中心線(xiàn)與小鼠外耳道位于同一直線(xiàn)上，然后將左、右耳桿分別推入外耳道，調節兩耳桿位置中心對稱(chēng)、且高度一致，螺絲鎖緊固定耳桿。進(jìn)一步地，上下調整適配器門(mén)齒扣位置，使其位置低于左右耳桿中心連線(xiàn)3.3±0.4mm，前后再次微調門(mén)齒扣、鼻梁與耳桿之間的位置，壓緊鼻梁，此時(shí)頭部已固定，顱骨水平位基本調平（注意：這個(gè)是初步判斷標準，還需進(jìn)一步判斷）、且鼻嘴處于適配器的麻醉面罩里、呼吸來(lái)自麻醉機的氣體維持麻醉（此時(shí)調節氣流量約1LPM，濃度約1%，可通過(guò)觀(guān)察動(dòng)物呼吸、夾捏尾巴等方法判斷）。
檢查頭部是否固定成功：鼻對正中，提尾不掉，目測大腦水平，從上、左、右、側各個(gè)方向推壓動(dòng)物頭部均不動(dòng)。

3、備皮
備皮前，于眼部涂眼膏。
用剃毛器剔除頭部毛發(fā)，碘伏和酒精棉球消毒，沿矢狀縫作一1cm長(cháng)的皮膚切口，分離皮下組織，去除顱骨表面的筋膜及肌肉，推開(kāi)骨膜，生理鹽水和棉球清潔，可清晰暴露前囟、人字縫及矢狀縫。

4、零點(diǎn)定位
定位儀夾持一金屬定位針，將金屬定位針移動(dòng)到矢狀縫上方后，再前后移動(dòng)定位針，使定位針剛好接觸定位到前囟點(diǎn)（Bregma），此步需借助帶LED燈的視頻顯微鏡放大判斷，提高定位準確性。

5、顱面二次調平
將定位針從前囟點(diǎn)開(kāi)始，第1步，沿矢狀線(xiàn)向后移動(dòng)到約2.5mm位置、左右各2mm位置，觀(guān)察在矢狀線(xiàn)上，定位針在前囟點(diǎn)和2.5mm位置點(diǎn)距顱面是否高度一致，以及在左右2mm位置點(diǎn)，定位針距顱面是否高度一致；第2步，繼續矢狀線(xiàn)向后移動(dòng)到約4.2mm位置，觀(guān)察在矢狀線(xiàn)上，定位針在前囟點(diǎn)和4.2mm位置點(diǎn)距顱面是否高度也一致。這兩步判斷，若不一致，需微調左右耳桿高度位置、門(mén)齒鼻梁處高度位置；
通過(guò)這個(gè)調節，顱面即可確定調平，讀數允許誤差±0.03mm。

6、目標腦區定位
首先，從腦立體定位圖譜或文獻確定目標腦區（紋狀體）的三維坐標，選取合適坐標點(diǎn)（AP+0.98mm,ML+2.0或者-2.0mm,DV-3.0mm），如下圖：
   
從前囟點(diǎn)開(kāi)始移動(dòng)定位針，在前囟前0.98mm, 矢狀縫左或右旁開(kāi)2.0mm處定位一點(diǎn)，用記號筆做好標記，即為紋狀體在X-Y平面的位置； 

7、鉆孔
選取合適大小鉆頭，比注射針稍大一點(diǎn)即可，手持顱鉆，或者將顱鉆夾持固定于定位儀上，在標記點(diǎn)處鉆孔。注意：掌握手感，切忌大力，鉆孔突破時(shí)，有明顯的落空感，此時(shí)后退顱鉆，如果再繼續鉆孔，會(huì )進(jìn)入腦組織，造成損失。另外，建議鉆頭蘸取生理鹽水或PBS進(jìn)行降溫。
鉆孔后，用醫用注射器的細針頭小心挑破硬腦膜，防止損傷，如果在此過(guò)程中有出血，可以用很小的醫藥棉球拉成長(cháng)條形將血吸走。

8、夾持注射針
抽取藥物于注射器，夾持于定位儀上，將注射器針頭定位于前囟點(diǎn)處，然后按坐標移動(dòng)到鉆孔窗口，繼續往下緩慢植入注射針。設置好注射參數（注射器規格【容量、活塞內徑】、目標注射體積、注射速率），即可開(kāi)始注射（參考：紋狀體注射1ul,速率約0.5ul/min；病毒注射1ul，速率約0.2ul/min）。
注射完畢，停針5-10min，使藥物充分擴散吸收，再緩慢退針。
注意：如果是病毒、細胞注射，選擇玻璃電極注射；如果是大容量注射，選擇漢密爾頓注射器注射。

9、動(dòng)物復蘇
縫合傷口，碘伏消毒，然后將小鼠從定位儀上取下，放置于飼養籠內。由于采用的是氣體麻醉，所以動(dòng)物蘇醒很快，約2分鐘。

10、定位點(diǎn)準確性驗證
在開(kāi)展正式藥物注射前，需做預實(shí)驗驗證目標腦區定位的準確性。推薦使用示蹤Dil染料（1周后取材檢測）、熒光金染料（2周后取材檢測）或者紅色、黑色染料（1周后取材檢測），然后取材做冰凍切片，對照腦圖譜的一些參照物來(lái)判斷腦區定位是否準確（可以選擇較大、清晰的參照物，比如海馬、側腦室、視交叉核團等）。
注意：切片從外向目標核團靠近且，注意大腦切片角度與腦圖譜保持一致。


配置清單：
序號 貨號 型號 名稱(chēng) 規格 單位 數量
1 10-0030 Nova1000 小動(dòng)物麻醉機 移動(dòng)型、異氟烷罐、POUR FILL、CAGE MOUNT。一體化集成功能配置：移動(dòng)支架、內置氣源泵、抽氣泵、廢氣吸收罐、大小鼠預麻箱、抽屜箱、置物籃及管路 臺 1.00
2 10-2203 　 小鼠定位儀專(zhuān)用面罩-G2 　 個(gè) 1.00
3 30-1130 SM100D 腦立體定位儀 小鼠、單臂、數顯 套 1.00
4 20-0190 i-Star300 編程式納升注射泵 毛細玻璃電極注射 套 1.00
5 19-7010 FASTRONG 顱鉆 0-35000RPM順逆轉，腳踏和手控 套 1.00
6 33-0002 PC-100 拉制儀   臺 1.00
7 33-3003 GN7000 磨針儀   臺 1.00
8 16-0050 FOI304 LED冷光源 色溫6000K，35W光強可調 套 1.00
9 16-0020 SM200B 體視顯微鏡 搖臂式雙目 套 1.00
10 18-8010 　 大腦手術(shù)器械包 13件套 套 1.00
11 18-8090 　 動(dòng)物手術(shù)消毒套裝 7件套 套 1.00
12 19-7001 　 小動(dòng)物剃毛器 　 套 1.00
13 19-7223 　 紅霉素眼膏 0.5%*2G（5支/包） 包 1.00



 
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