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線(xiàn)栓法MCAO造模實(shí)驗解決方案

日期：2013-03-26 20:46:31點(diǎn)擊：0
大腦中動(dòng)脈阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO) 是目前最常用的局灶性腦缺血模型，MCAO 模型先阻斷頸外動(dòng)脈（ECA）及其分支，且阻斷翼腭動(dòng)脈（PPA），以切斷顱外來(lái)源的側副循環(huán)血流。從ECA 插入尼龍線(xiàn)，經(jīng)頸內動(dòng)脈（ICA）到大腦前動(dòng)脈（ACA），機械性阻斷大腦中動(dòng)脈（MCA） 發(fā)出處的血供來(lái)建立大腦中動(dòng)脈缺血模型。此模型可在無(wú)麻醉狀態(tài)下拔出尼龍線(xiàn)，恢復血流，實(shí)現再灌注。 線(xiàn)栓法具有不開(kāi)顱、效果肯定、可準確控制缺血及再灌注時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)，用于研究神經(jīng)元對缺血的敏感性、耐受性，藥物療效觀(guān)察以及再灌注損害和治療時(shí)間窗較為理想，同時(shí)也具有對全身影響小、動(dòng)物存活時(shí)間長(cháng)的特點(diǎn)，適于慢性腦損傷的研究?？刂坪靡鬃円蛩?，可避免實(shí)驗結果的不穩定性。
1、主要器材
（1）缺血前準備：腦立體定位儀、（小鼠適配器）、微量注射泵、微量注射器、顱鉆
（2）缺血模型制作：氣體麻醉機、異氟烷、體視顯微鏡、冷光源、手術(shù)臺、術(shù)后保溫箱、腦模具、手術(shù)器械包
（3）缺血模型評價(jià)：神經(jīng)功能評價(jià)法（BBB評分）、TTC染色、病理學(xué)評價(jià)
（4）缺血后行為檢測：抓力測試儀、轉棒儀......
2、實(shí)驗動(dòng)物
（1）SPF級Wistar大鼠，健康，雄性，體重為250-300g。
（2）SPF級C57小鼠，健康，雄性，體重為18 - 25g，實(shí)驗Protocol和視頻，請點(diǎn)擊觀(guān)看和下載: Click Here
3、實(shí)驗分組
實(shí)驗分六組：正常對照組、模型組、陽(yáng)性藥組、受試藥組三個(gè)劑量組，每組15只動(dòng)物。
4、建模方法（以大鼠為例）
（1）1.5-2%異氟烷氣體麻醉大鼠，頸部備皮，消毒，插入肛溫探頭，保持體溫在37±0.5℃。
（2）頸部正中切口，暴露右側頸總動(dòng)脈，頸內動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。使用6-0絲線(xiàn)在距離頸總動(dòng)脈分叉4mm處結扎頸外動(dòng)脈遠心端，在頸外動(dòng)脈穿入另一根6-0絲線(xiàn)，在靠近頸總動(dòng)脈分叉處打一個(gè)活結。
（3）使用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈。在距離頸總動(dòng)脈分叉處3mm處的頸外動(dòng)脈上剪一個(gè)小口，將一根頭端處理過(guò)的0.33mm直徑的尼龍線(xiàn)從小口中插入，進(jìn)入頸內動(dòng)脈，并向內插入大腦中動(dòng)脈，尼龍線(xiàn)的插入深度距離頸總動(dòng)脈分叉處約16±1mm。
（4）缺血后90min拔掉線(xiàn)栓，用6-0絲線(xiàn)結扎外動(dòng)脈近心端，用3-0絲線(xiàn)縫合頸部傷口，活力碘消毒傷口，將大鼠放在加熱墊上，待清醒后放入恒溫撫養箱飼養。
（5）術(shù)后24h，對小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，然后繼續麻醉大鼠，取大腦切片、進(jìn)行TTC染色和病理染色。
5、模型的評價(jià)
（1）神經(jīng)功能缺失體征評分
參考 Longa 及Bederson 的5 分制法在動(dòng)物麻醉清醒后24h 進(jìn)行評分，分值越高,說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴重。
0 分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀
1分：不能完全伸展對側前爪
2分：向對側轉圈
3分：向對側傾倒
4分：不能自發(fā)行走,意識喪失
（2）TTC染色
麻醉大鼠后 ，取大鼠腦組織 ，放入 -20 ℃冰箱冷凍 30min 30min。用 PBS配置 1% TT C（W/V ），37 ℃水浴至 TTC 溶解， 將凍好的腦組織切片 ，置于 10ml TTC 溶液 中， 37 ℃恒溫孵育 10min。不時(shí)翻動(dòng)腦片，使 組織均勻染色。正常腦染色后呈鮮紅，而梗死區呈蒼白。
附：小鼠缺血2h后TTC染色效果圖，如下：

（3）病理學(xué)評價(jià)
取腦后用 4% 多聚甲醛溶液 固定，蔗糖溶液脫水后經(jīng) 固定，蔗糖溶液脫水后經(jīng) 固定，蔗糖溶液脫水后經(jīng) OCT 包埋做冰凍切片 ，包埋做冰凍切片 ，10um ， 做尼氏染色， 做尼氏染色可做梗死面積的評價(jià)。
 
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